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产品信息
| 适用范围 | 试剂 |
|---|---|
| 使用方法 | 一、试剂配制 1. 培养瓶包被液：18ml PBS加入本试剂盒1支试剂Ⅰ、1支试剂Ⅱ。 2. 增殖培养基：每1000ml免疫细胞无血清培养基中加入本试剂盒1支试剂Ⅴ。 3. 活化培养基的配制：配制完增殖培养基后，取出500ml增殖培养基，加入本试剂盒1支试 剂Ⅳ、1支活化培养基添加物。 二、取材 取材时使用一次性负压采血管抽取自体外周血 50ml。（建议使用枸橼酸钠或肝素抗凝剂） 或临床获得健康新生儿脐带血。（建议使用枸橼酸钠或肝素抗凝剂）。 三、NK细胞的培养 1. 培养前：T175 培养瓶中加入包被液，2-8℃冰箱过夜，或置于 37℃培养箱中至少包被 2h。 2. 第0天：取出2支高效离心管，分别加入15ml样本密度分离液，200g离心1min，确保离 心后隔片下充满分离液，隔片上有0.5-1cm高度分离液。小心将25ml抗凝血缓慢沿管壁 加至分离液界面上，确保血液及分离液之间有明显界面（每管可加15-25ml血液，若超过 25ml，则分管）。600g，离心30min（也可根据实际情况进行调节），注意慢升慢降。 3. 离心后可观察从上至下分为4层，淡黄色血浆层，白色环状PBMC层，分离液层，红细胞 层。用吸管吸取血浆层，做灭活处理。 灭活步骤：置于水浴锅中56℃，30min；然后-20℃静置10min；最后800g，离心 15min，保留上清弃去沉淀，短期保存于4℃备用，长期保存请置于-20℃~-80℃环境下。 4. 用吸管吸取 PBMC 细胞层至 50ml 离心管中，为尽量获得更多细胞，建议隔片以上部分 全部吸取，注意不要吸到红细胞。在 PBMC 离心管中加入 PBS 混匀（PBS 量要多于吸取 的 PBMC 体积），600g，离心 10min。弃去上清，加入 PBS 复溶洗涤，300g，离心 10min。 5. 分离出的 PBMC 用未加任何因子的免疫细胞无血清培养基配制成细胞悬液 40ml，加入 1 整套试剂Ⅲ（5 支全部加入），加入 1 支试剂Ⅸ。将上述所有液体加入到弃掉包被液的培 养瓶中，加入 8ml 自体血浆，置于饱和湿度、37℃、5.0% CO2 培养箱中培养。（注：建 议接种密度为 1-3×106 个/ml，如分离后细胞数少，则相对应减少培养基及血浆使用量， 但是活化因子添加量不变。） 注意：先使用完所有活化培养基，再使用增殖培养基。由于个体差异问题，每个样本生长 速度不一致，添加培养基的时间不一定要严格按照以下时间进行，需根据具体情况具体分 析， 确保细胞已经活化成功，呈现聚团生长的情况，细胞数量有增殖。在补加培养基后， 细胞密 度维持在 1×106 个/ml，有利于细胞的生长。 6. 第 3 天加入 40ml NK 活化培养基，加入 5ml 血浆，加入 1 支试剂Ⅸ，1 支试剂Ⅵ。 7. 第5天加入70ml NK活化培养基，加入5ml血浆，加入1支试剂Ⅸ，1支试剂Ⅶ。 8. 第7天将培养瓶中细胞完全吹打下来，轻轻摇匀瓶内培养液，无菌取出0.5ml-1ml细胞液 计数，视细胞生长状态及细胞密度，建议加入剩余自体血浆并补加剩余的活化培养基。转 移到1个培养袋。 9. 第9天：轻轻摇匀袋内培养液，无菌取出0.5ml-1ml细胞液计数，视细胞生长状态及细胞 密度，建议培养袋补加增殖培养基500ml。 10.第11-12天轻轻摇匀袋内培养液，无菌取出0.5ml-1ml细胞液计数，视细胞生长状态及细 胞密度，建议培养袋补加增殖培养基1000ml 。（细胞总量达到20亿时进行此项操作） 11.第13-15天轻轻摇匀袋内培养液，无菌取出0.5ml-1ml细胞液计数，细胞总量达到30亿时， 建议培养袋补加增殖培养基1000ml。此时取样做细菌、真菌、支原体、内毒素检测。 12.第15-18天轻轻摇匀袋内培养液，无菌取出0.5ml-1ml 细胞液计数，细胞总量达到60 亿 时，将1500ml培养液转移至一个新的3L培养袋中，建议每个培养袋补加增殖培养基1500 ml。此时取样做细菌、真菌、支原体、内毒素检测。 13.第18-21天，收集NK细胞悬液6000ml，1500rpm×5min离心后弃去上清液，250ml离 心管集2管每管生理盐水200ml洗涤（ 1500rpm×8min ）1次 ，再用50ml离心管生理 盐水 100ml洗涤（1200rpm×5min ）1次，按照100ml生理盐水+ 8ml 20%人血清白 蛋白重悬细胞，封装好后备用，同时留样封存以备日后检测。 注：分批收获细胞：扩袋培养时，可收获一部分的细胞，剩余的部分继续补加增殖培养基 进行扩增（原则为按照细胞密度补液），客户可按照方案分批收集或一次性收集。 |
| 注意事项 | 1. 使用前请仔细阅读本试剂盒说明书，并严格按照说明书执行操作。 2. 本试剂盒必须按规定温度保存，不可反复冻融。试剂在使用前需解冻，并充分混匀，不 可剧烈震荡。 3. 可视细胞生长的实际状况适当调整补液时间和用量。 |
| 声明 | 仅用于科研使用，不能用于临床诊断和治疗。 |
| 保存条件 | 根据说明书内容，有效期12个月。 |
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