贝博生物 细胞外酸化检测试剂盒BB-48311

产品概述 product description

贝博® BBcellProbe® 细胞外酸化率（ECAR）检测试剂盒（Extracellular acidification Rate Assay Kit）是利用贝博® 合成的酸化检测荧光探针BBcellProbe® P61来检测细胞外酸化情况变化的试剂盒。可以通过简单的混合基于荧光酶标仪便捷的直接进行细胞外酸化情况的动态实时测定。 细胞外酸化（Extracellular Acidification ；ECA）测量可以为糖酵解（glycolytic）活性研究提供丰富的信息，本试剂盒可用于代谢表征并确定具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控）如何影响糖酵解通量。 细胞代谢与癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、肥胖、糖尿病及干细胞等多个领域息息相关。糖酵解是真核细胞中的关键代谢途径，在分化、增殖和 ATP 生成等生理过程中起重要作用。糖酵解的改变对多种疾病也具有重要意义，包括但不限于癌症、心血管疾病和代谢疾病。 能量代谢指标胞外酸化率（ECAR）可帮助研究人员更多地了解细胞对外界的应激反应和运作机制。但以往细胞代谢的检测技术存在较多限制，例如难以对细胞代谢进行连续、实时的检测；一些专门检测细胞代谢的仪器、硬件贵，试剂耗材消耗成本高，实验重复性低且只能检测有限指标。 与传统的终点糖酵解分析不同， 使用BBcellProbe® P61糖酵解分析可以实时测定细胞外酸化率 (ECAR)，可以观察糖酵解机制的短暂变化和快速反应。样品不需要密封处理，在这些条件下， ECAR 是一种可靠且稳定的糖酵解活性测定方法。 BBcellProbe® P61细胞外酸化分析可以实时测量细胞糖酵解活性，是以高通量形式来评估用于代谢表征的细胞呼吸以及评估治疗对细胞功能毒性作用的一种可靠方法。 它可以使用荧光酶标仪在标准微孔板上进行简单动力学测定。随着糖酵解作用的进行，丙酮酸转化为乳酸，这将导致细胞外环境 pH 降低。P61探针可以灵敏地检测到 pH 降低，并表现为BcellProbe® P61探针荧光信号增加，从而实现对ECAR的测定。 BBcellProbe® P61最大激发波长为 488nm，最大发射波长为 580nm。其荧光在碱性条件下强度较弱，反之酸性条件下变强，从而BBcellProbe® P61可被用于监测细胞外酸化的变化。在测定中，细胞外酸化率由荧光信号随时间的变化计算。细胞外酸化增加，荧光信号的变化率增加；反之，酸化减少，荧光信号的变化率降低。 BBcellProbe® P61与乳酸的这种反应是非破坏性且完全可逆的，BBcellProbe® P61没有细胞毒性，其是化学稳定的，惰性的，水溶性的和细胞不渗透的，不能透过完整的细胞膜。因此还可以同时与细胞耗氧率， 线粒体膜电位， ROS和细胞ATP 、LDH等检测的试剂结合使用，进行多参数检测。 用BBcellProbe® P61进行细胞外酸化检测方法及其简单，不需要适用特殊的仪器设备，只需要荧光酶标仪之类的荧光读板设备即可。 BBcellProbe® P61采用可见光激发检测，相对于采用紫外光激发的检测试剂，细胞损伤更低，对细胞的毒害更小。结果更加准确客观。 贝博® BBcellProbe® 细胞酸化检测试剂盒可以用于直接，实时分析细胞外酸化情况。本试剂盒可以用来测量各种全细胞（贴壁和悬浮细胞），各种3D培养物，组织，小生物，球体，支架和基质等。 以96孔细胞培养板计，本试剂盒小包装可以检测200个样本。

保存温度

2-8℃ 避光

注意事项

1.探针-20℃密封避光保存；
2.避免反复冻融。可以根据实验进度安排小量分装保存；
3.探针P61需要配制成工作液后使用，注意看操作步骤以及注意事项；
4.检测缓冲液为无菌试剂，注意防止污染；
5.试剂拆封后请尽快使用完！

有效期

6个月

检测方法

荧光酶标仪

适用样本

细胞

产品特点

1.广泛适用于各种体外模型；不再局限于单层细胞，还能测定悬浮细胞和特定的 3D 培养物；
2.简单的“混合-检测”方案允许使用多种其他分析试剂盒进行多参数分析；
3.无损可逆转，能够观察细胞外酸化的瞬态和长时间变化；
4.可适配多数荧光酶标仪以及标准 96 孔和 384 孔；
5.以高通量的形式方便地测量； 6.无需等待专用设备空闲所需的实验室时间，也无需大额资金专用设备投入

产品应用

细胞代谢研究

仪器准备

1.荧光酶标仪
须配备相应的波长过滤器和温度控制器。
须配备温度控制器。
2.离心机
3.pH计
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

试剂准备

1.PBS缓冲液或者HBSS  2.KOH / HCl
3.对照试剂（选配，非必须）：
Glucose Oxidase，2-Deoxyglucose，寡霉素A，抗霉素A，FCCP

耗材准备

1.黑色透明底荧光专用培养板
2.0.22 μm针头过滤器
3.离心管
4.吸头
5.一次性手套

使用注意事项

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3.以下操作以96孔细胞培养板为例。其他培养容器或装置请根据实际情况调整试剂用量和检测方法。各试剂等比例调整即可。
4.BBcellProbe® P61探针的信号变化直接取决于所测量细胞类型的细胞外酸化速率，建议尽可能使用每孔高的细胞密度作为起点，并根据需要减少细胞数量。
5.并非所有细胞类型都产生足够用于检测的酸化。
6.最好使用荧光培养专用的透明底黑色培养板。实在没有的话可以采用透明板，注意细胞孔间隔开，减少检测时各孔之间的光互相干扰。
7.用于测定的所有仪器试剂溶液耗材均需37℃预热。
8.尽可能使用多通道移液器添加试剂。
9.建议每个测试样做3复孔。
10.试剂盒所配的检测缓冲液不能用其它缓冲液（如PBS/HBSS等）或培养基代替。说明书中所有提到使用检测缓冲液B的地方必须使用试剂盒所配的检测缓冲液。
11.待检测样本量较多时，可以采用简化的试剂配制步骤：将100 μL P61探针试剂（母液）添加到9900 μL预热的检测缓冲液中（100倍稀释），并使用多通道移液器，将100 μL稀释的含P61探针的检测缓冲液液添加到每个孔中（非空白对照孔，空白对照不含探针）。
12.ECAR/糖酵解测定通常允许同时实时测量多参数（或多重）组合，常与细胞耗氧量（OCR）同时测定（相关产品货号：BB-48211），分析细胞的代谢表型以及测定糖酵解和线粒体呼吸两种途径之间的转换情况。

使用方法

关于仪器设置：
 温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪。
 常规的荧光信号强度测量，使用基于单色仪或基于过滤器的酶标仪，最佳激发波长使用488 nm或514 nm，发射波长使用580-590 nm。可根据实际机器和样本选择信号最强的波长。
 具有检测增益参数（PMT，Parameters）的通常设置为中或高。
 一般使用底部读数bottom read。


关于细胞培养：
 对于贴壁细胞，在200 μL培养基中的96孔板中接种细胞。在37 ℃ 的CO2培养箱中孵育过夜。
 对于悬浮细胞，在检测当天在100 μL培养基中接种。
 注意所需的接种密度取决于细胞类型。 我们推荐进行细胞接种密度预实验以确定最佳密度。通常从高细胞密度（通常为60,000-80,000个）开始，每孔的最佳细胞数一般为：贴壁细胞每孔80,000个细胞，悬浮细胞每孔5-6 x 105（96孔板）。
 检测待测样品都设置3复孔。
 注意始终在每个96孔板上留出至少6个孔，以免添加细胞作为空白对照和信号控制孔。
 如果将细胞在CO2培养箱中培养过夜，则去除二氧化碳非常重要，残留的二氧化碳可能会导致酸化。在进行P61酸化检测之前先将培养板残余二氧化碳进行去除，方法是提前通过在37℃，湿度为95％的无二氧化碳培养箱中培养细胞约两个小时。


关于细胞接种密度测试：
 对于不同的细胞，对于相同细胞的不同干预模型，最佳的细胞接种密度是不同的。有条件的话坐下细胞接种密度测试可以得到更好的实验结果。
 （推荐细胞接种密度测试，以下可选，非必须）：
为了确定待测细胞模型的最佳接种密度，在实验前，选择一系列细胞接种密度，测定荧光强度与时间函数数据，然后确定正式实验的接种密度。

关于对照孔设置：
 一般空白孔要设置，其它对照根据实验需要决定。
 （推荐对照设置，以下可选，非必须）：


操作步骤：
1. 探针工作液试剂配制：
用试剂B检测缓冲液10倍稀释探针P61（母液）（每100 μL P61探针中加入900 μL检测缓冲液），充分混匀，配制成P61探针工作液，备用。
2. 准备细胞模型。
3. 培养好的待检测细胞移除培养基，用检测缓冲液洗涤细胞两次。每次洗涤每孔使用100 μL检测缓冲液。
4. 去除第二次洗涤的检测缓冲液，加入90 μL新的检测缓冲液。
5. 每孔加入10 μL BBcellProbe® P61酸化荧光探针，充分混匀。
6. （可选）可以在此处添加待测试化合物药物（通常为1-10 μL）（如果需要的话）。
7. 然后用该细胞板进行荧光细胞外酸化变化情况检测。用荧光读板设备读取该细胞板的荧光数据。
激发波长488 nm，发射波长580 nm-590 nm。
每2分钟或3分钟读取一次。测量时间大于120分钟。
8. 绘制酸化率曲线。
9. 计算每个样品的斜率值。

常见问题分析

1.酸化率检测趋势跟预期的不一致？
检查细胞接种和移液的一致性。
增加细胞密度。
将测定体积减少到60微升。
在某些较短的检测时间区间内，会出现荧光数据的波动情况，出现斜率下降或不变化，需要扩大到更长的时间范围内来分析酸化率趋势。一般检测时间范围不少于60分钟。
温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪，仪器以及所有培养基和储备溶液均须使用前37℃预热。注意某些读板器的温度控制不一致，如果存在这种情况，请考虑将测定和平衡温度降低到30℃。
避开培养板外圈。

2.使用的细胞类型灵敏度不够？
可以考虑以下改善方案：
增加酶标仪的增益（PMT）设置。
增加BBcellProbe® P61酸化荧光探针的体积（15μL/孔）。
增加细胞密度。
将测定体积减少到60微升。
测量底部读数（如果有）。
调整TR-F焦距。

3.我无法在含有细胞的孔中检测到任何信号，或者我可以检测到信号，但斜率（速率）显得很低？
检查正确的仪器设置，设置信号优化。
增加细胞密度。
将测定体积减少到60微升。
避免使用微孔板的外圈孔。